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http://www.ntuvmdc.net/en/custom_83994.html 貓傳染性腹膜炎及其滲出液之診斷 貓傳染性腹膜炎及其滲出液之診斷 貓傳染性腹膜炎及其滲出液之診斷 羅以真、陳慧文傳染病與免疫實驗室 (獸醫一館101室)國立臺灣大學獸醫學系 病原介紹貓冠狀病毒屬於冠狀病毒科,是一個有封套的單股RNA病毒,在其基因位上分為序列較保守的非轉錄區段(Untranslated region)與變異性較大、可以轉譯出蛋白質的區段(Coding region),貓冠狀病毒可以轉錄出的蛋白質主要又分為以下幾種:棘突蛋白質(Spike protein; S)、外膜蛋白質(Envelope protein; E)、膜蛋白質(Membrane protein; M)與核鞘蛋白質(Nucleocapsid protein; N),在這些蛋白質中,棘突蛋白質在各病毒株之間是變異度較大的,而核鞘蛋白質則是表現量較大的 [1-3]。貓冠狀病毒依致病性分成兩型,分別是僅造成是輕微腸炎的貓腸型冠狀病毒(FECV)以及具高致死率的貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV) [4],而在流行病學上,不論是貓腸型冠狀病毒或者是貓傳染性腹膜炎病毒,都可以依棘突蛋白質的抗原型區分成第一血清型(serotype I)與第二血清型(serotype II)[5],其中第ㄧ血清型在世界各地都是較為流行的毒株 [5-7]。致病機轉目前對於貓傳染病腹膜炎的致病機轉仍沒有定論 [4],但較被接受的理論是貓腸型冠狀病毒(FECV)在貓消化道內突變後,由原本對上皮細胞親和性轉為對單核球與巨噬細胞的親和性,而進入血液循環中,不僅如此,致病的病毒能在單核球與巨噬細胞中大量增殖、並感染其他細胞造成全身系統性的感染,而由受感染的巨噬細胞因免疫失調而攻擊血管內皮細胞,進而造成嚴重性不等的血管炎症狀。而因為目前並沒有找出造成輕微腸炎的貓腸型冠狀病毒(FECV)以及十分致死的貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)之間的病毒區別[4],對於好發族群的研究也有些出入,對於貓傳染性腹膜炎的病發仍無定論。但目前大多研究指出雄性、純種、年幼(<2歲)與多貓家庭中的貓有較高傾向發病,有學者指出因為雄性貓咪的賀爾蒙與喜好打鬥的習性,會影響免疫系統而更容易造成失調而病發。貓傳染性腹膜炎依期病程進展速度主要分為兩種,病程較快速較急性的屬於濕型傳染性腹膜炎,感染濕型的貓的血管內皮受損嚴重其體腔內常會見到有體液蓄積,若是體液出現在胸腔則容易見到貓有呼吸困難的現象,而若體液出現在腹腔則常可以見到貓的腹圍膨大,而由於濕型的病程較為快速,貓隻在發病診斷後平均壽命僅約9天; 另一種較為慢性的屬於乾型傳染性腹膜炎,血管受損程度較輕微並不會造成血管內液體滲出的情形,但是受損的器官可見結節樣病變,而乾型的症狀較不一致,會依病毒攻擊臟器不同而異,如病毒攻擊肝臟則容易造成黃疸的症狀,而若病毒攻擊腎臟,則可能造成腎指數升高的情形等,症狀差異大因此較難診斷。 實驗診斷FIP的生前診斷是有其難度的,除了好發群體尚無定論且各發病個體的症狀不顯著外,症狀的差異可能很大,因此較難利用症狀或病貓的性狀快速確診,加上高致病的FIPV 與非致病的FECV目前為止並無法在基因序列上作區別,目前最具有診斷效力的方式,仍然以在病變處藉由免疫染色法標定出巨噬細胞內病毒所表現的蛋白質為主。值得注意的是因為FIP目前並沒有有效的治療方法,而確診為FIP後通常只有對症治療或者安樂死,因此在實驗室的診斷上高特異度去排除感染情形,可能相對比高敏感度重要,能夠避免非必要的安樂死 [8]。乾式的腹膜炎由於症狀不明顯,常需經由剖檢確診血管結節狀的病變才能確診; 而濕型的腹膜炎雖然症狀較明顯,但仍需要與其他可能造成胸腹水的疾病如:細菌性感染、腫瘤、肝臟疾病、肺炎等等做區別,此外,即便胸腹水之檢體可以用來做檢測,若延誤送檢,也會導致檢體不新鮮而不容易確診,以下針對FIP造成之滲出液說明幾種常見的實驗室診斷方法: 免疫螢光染色 (IFA)免疫螢光染色法(immunofluorescence assay; IFA)是目前針對濕型FIP較具公信力的生前診斷方法,能夠檢測細胞中的抗原存在 [8]。FIPV免疫螢光染色診斷是針對病毒上的N蛋白做檢測 [1],N 蛋白為病毒在細胞中表現量較大的蛋白,故選用之以提高敏感度。貓若開始發展FIP,其病灶的巨噬細胞質內就會有病毒蛋白的存在,而利用對於N蛋白具專一性的一級抗體即可以辨認細胞內的N蛋白,再利用帶有螢光物質、並能辨識一級抗體的二級抗體去標的結合,之後在螢光顯微鏡下觀察呈色情形、並辨識蛋白質存在的位置(如圖)就能夠確診。但是免疫螢光染色成本較高,且操作者本身的經驗很重要,包括染色時間與去除非特異的呈色的方法等等,都需要熟練的操作才能避免抗體發生非特異之結合,另外判讀染色結果的人員亦十分重要,如何區別非特異的呈色並做診斷,需由具有在鏡檢下區別細胞的能力、且具有判讀螢光染色的經驗的操作者執行,才能進行較具有可信度的判斷,而不同的判讀者對於測驗診斷的敏感度與特異度均有差異 [1],加上判讀需使用解析度較高且能顯示螢光的特殊顯微鏡,因此此法雖被文獻證實有極高的診斷特異度 [9] [10],卻僅被應用於設備較完善的實驗室而非臨床動物醫院中。此外,檢體的品質也會影響判讀,若胸腹水抽取過程中操作不當而受嚴重的血液污染,則有可能影響蛋白的結合而影響判讀結果,因此建議抽取檢體時需搭配超音波,以避免抽取過程中針頭誤刺臟器而造成血液污染與組織污染檢體; 此外,檢體保存不當造成細胞受損嚴重或者細胞數過少亦為影響判讀的原因之一,文獻結果顯示,胸腹水抽出後若保存在4。C冰箱相比於室溫保存,最多能延長七天的檢測期,也就是說若能夠確保檢體在抽取後與運輸過程中皆能低溫(非冷凍)保存,則將更能提升檢出率,另外在最短的時間內送檢也是很重要的,文獻顯示一些品質較差的檢體,即便抽取後隨即保存在低溫,其檢測期限也僅有兩天之久,所以除了低溫保存外,在最短的時間內送檢也是另一個影響檢出率的重點 [1]。 Fig A. 在顯微鏡下定位巨噬細胞,細胞核大而偏一邊核質比小且細胞質中充滿空泡,細胞的表面有許多細小突出,整體細胞大小大多約落在直徑10-20 µm之間[11]。Fig B.在免疫螢光染色下,含有病毒顆粒的巨噬細胞細胞質呈現綠色螢光反應而細胞核呈藍色螢光。不均勻的病毒顆粒分布使得綠色螢光顆粒而不均質,而輪廓清晰的細胞核空洞代表著螢光染色十分具有特異性,僅與目標病毒蛋白質結合而不與細胞核中的蛋白質鍵結。 ²  偽陽性可能原因:其他蛋白質或雜質造成之非特異性結合、檢體污染²  偽陰性可能原因:病程初期病毒蛋白質表現量低、檢體不新鮮、細胞數不足、細胞品質差 Rivalta test [12]Rivalta test 是一種可以區分低蛋白的濾出液(transudate)與蛋白質含量較高的滲出液(exudate)的一種簡便檢測,適合醫院裡的小實驗室,其操作方法如下:首先取一個10 ml 的透明塑膠離心管,先在裡面裝7-8 ml的蒸餾水,並於其中滴入一滴(20-30 µl)的高濃度(98%-100%)醋酸混勻,事後將事先準備好的檢體利用微量吸管滴一滴(20-30 µl)於Rivalta 液上,若檢體蛋白含量低便會很快的在Rivalta 液體中散了開來,回歸到透明澄清的狀態,則被認為是Rivalta 陰性; 反之,若檢體蛋白含量高則會在表面形成白色的沈澱並緩慢的沈降至管子的底部,則判定為檢測陽性。誠如敘述,Rivalta 是一個簡單又快速的檢測適合臨床上做初步的篩檢,僅能大略以滲出液的成分區別,但他並不能區別形成滲出液背後的原因,因此並無法區別FIP與其他可能造成滲出液的疾病如:感染、癌症或異物刺激等等,甚至一些非FIP所造成的胸腹水也可能具有類似異物的效果,刺激胸腹膜並進而生成滲透液,導致Rivalta test的偽陽性,而Rivalta test 偏低的特異度與陽性預測值,也是它並不適合作為唯一診斷準則的原因。 ²  偽陽性可能原因:其他病因所造成的滲出液(異物刺激、癌症、感染)²  偽陰性可能原因:貓隻同時有低蛋白血症症狀 反轉錄聚合酵素鏈鎖反應 (RT-PCR)反轉錄聚合酵素鏈鎖反應(Reverse transcription-polymerase chain reaction; PCR)是利用特定的引子對(primer pair))去增幅待測的病毒RNA,因此即便僅有微量的RNA也可以偵測得到,是一個敏感度相當高的檢測,正因為檢測敏感度非常高,若檢體稍有污染,極可能造成檢測偽陽性的問題。但若病毒已發生基因變異,或者檢體保存不當—沒有低溫保存,使檢體中的RNA水解酵素將檢體中的RNA降解,都是導致無法檢測到病毒RNA而使得敏感度下降的原因。另一項關於PCR 診斷FIP 的限制,在於PCR 並無法確切指出病毒的所在位置,但要確診FIP 最好要能夠證實病毒確實存在在巨噬細胞內而非源自於外源性的污染而游離於檢體裡,因此雖然PCR 十分敏感,但仍不能做為診斷的唯一依據。目前會用在FIP診斷的PCR類型主要有兩種,一是特異度較高且可以做分型的nested PCR,另一是可以定量檢測的Real-time PCR;前者雖利用兩段PCR 提高敏感度與特異度,但是耗時較長;後者雖耗時較短,且可以透過定量了解病毒在貓隻體內複製的情況,但是要價較昂貴。PCR 雖不是最具診斷公信力的方式,但是不可否認的,PCR 在病毒存在之檢測與分型上仍是十分好用的工具。 ²  偽陽性可能原因:其他種類冠狀病毒基因污染、受含有病毒的血液污染、檢測操作過程污染²  偽陰性可能原因:檢體保存不當、基因變異、病毒數過少 恆溫環狀擴增法(LAMP) [13]LAMP(loop-mediated isothermal amplification)類似於PCR,亦是利用增幅特定基因片段來檢測病毒核酸的存在,利用多組的引子環型的構造而最終產出長鏈狀的DNA產物,LAMP的優勢在於不需透過昂貴儀器,僅需普通之恆溫(65。C)加熱儀器下即可完成長鏈片段的增幅,且LAMP不需透過膠體電泳,可藉由肉眼觀察沈澱、螢光試劑或加入EtBr與甲基藍等方式,相較PCR方便容易,唯LAMP用作FIP診斷的研究較少,且特異度較低,並非目前主流使用之方法。 ²  偽陽性可能原因:其他種類冠狀病毒基因污染、受含有病毒的血液污染、檢測操作過程污染²  偽陰性可能原因:檢體保存不當、基因變異、病毒數過少 血液學檢查 [14]有三分之一的貓有非貧血性小紅血球症,推測與FIP的病程影響腸道鐵質吸收有關,因此可見到血球染色較淡的情形;白血球相最常可見到淋巴球缺少症,推測由於FIP所引發的T淋巴球凋亡和濕型傳染性腹膜炎中血管病變旁常見的淋巴球圍管現象有關,而嗜中性球增多症也是另一個常見的白血球相,值得注意的是FIP所造成的是中性求增多症雖伴有中等至嚴重程度的核左轉現象(嗜中性球的核不分葉,範圍1000-8769/µl),但是仍是存在有許多成熟核分葉的嗜中性球,原因是因為FIP所誘發的核左轉推測與病毒感染後所誘發的骨髓非特異性增生的情況有關, 並非造成大量嗜中性球的消耗與死亡後才誘發的骨髓增生,因此仍可見到許多成熟的嗜中性球,相較之下其他細菌性感染所引發的嗜中性球核左轉現象是由於大量成熟嗜中性球消耗所引起的,因此幾乎很難見到成熟的嗜中性球,此點在臨床上可以作為區別FIP與細菌性感染所造成的胸腹水的診斷依據。 血清生化學檢查 [14]高膽紅素血症是一常見FIP的血清生化異常,主要是與血管損傷而造成紅血球的脆弱而容易破裂有關,不過值得一提的是,最容易與傳染性腹膜炎混淆的細菌感染所造成的血管炎,也會有因為發炎而造成膽紅素代謝減緩而致的高膽紅素血症,因此雖然高膽紅素血症常見,但並不能做為FIP的診斷依據。白蛋白與球蛋白比值(A/G ratio)低下是FIP血清生化學中最具診斷價值的一項數值,在感染的貓之中常有免疫失調而可見抗體異常增加的情況,而加上白蛋白在炎症反應時會減少,而有胸腹水的貓會伴隨著白蛋白隨著滲出液滲出的現象,因此而造成了貓隻的A/G ratio較低,而目前研究指出,以A/G < 0.8作為診斷FIP的臨界值(cut-off value)具有較高的敏感度與特異度,若A/G < 0.5 則會認為是與FIP有高度關聯性。此外,雖然不具有特異性,血檢中的SAA與fAGP上升也同樣是FIP疾病的指標之一。 血清學若貓有感染過冠狀病毒不論是致病性的FIPV 或者是非致病的FECV,在血清中都會出現抗貓冠狀病毒的抗體,因此大多貓隻體內都可以測到抗體。血清學檢查有許多限制,它既不能區別過去的與現下的感染,僅能大略的從抗體力價去做區別,亦不能區別致病毒株FIPV 與非致病株FECV 之區別 [15]; 此外,動物的感染狀態也會影響檢測的結果,如濕型的腹膜炎的貓隻會在短時間內消耗許多抗體,反而偵測不到的偽陰性的情形;抑或是當下動物免疫力尚良好而有能力生成較多抗體,而此高抗體力價並不一定能代表動物一定是因為該病毒感染而發病。因此若單靠檢測抗體力價去斷定有無感染致病性FIPV常是不夠準確的,然而抗體檢測雖不具有良好的疾病診斷能力,在文獻上曾提出,能夠做為貓冠狀病毒感染上的分型。 結論診斷FIP並不容易,需有具豐富經驗的臨床醫師透過對貓隻可疑之臨床症狀、性狀做篩檢後,以正確的方式抽取、保存檢體並在短時間內檢測檢體,以確保檢體品質,並交由設備完善、操作經驗豐富的診斷單位檢測,方能獲得可信的檢測結果。 參考文獻1.          Litster, A.L., R. 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